菌落總數(shù)檢測技術(shù)要點(diǎn)

食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（或1g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。

按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在平板計(jì)數(shù)瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

細(xì)菌總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品樣品．經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗螅陲@微鏡下對細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1g或1mL或1cm²樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。

1、食品中細(xì)菌數(shù)量可反映該食品被污染的程度 

新鮮的食品內(nèi)部一般是沒有或很少有細(xì)菌的，但由于外界污染情況不同，食品被細(xì)菌污染的多少就有所不同。食品中細(xì)菌數(shù)量越多，說明被污染的程度就越嚴(yán)重，越不新鮮，對人體健康威脅越大。相反，食品中菌數(shù)越少，說明該食品被污染的程度越輕，食品衛(wèi)生質(zhì)量越好，對人體健康影響也越小。 

2、食品中細(xì)菌數(shù)量可預(yù)測食品耐放程度和時(shí)間 

一般講，細(xì)菌數(shù)越少，食品耐放時(shí)間越長；相反，食品耐放時(shí)間就越短，例如用0℃保存牛肉，菌落總數(shù)為l0³CFU/cm²時(shí)，可保存18天，而當(dāng)菌落總數(shù)增至l0⁵CFU/cm²時(shí)則只能保存7天。另外，用0℃保存魚時(shí)，菌落總數(shù)為l0⁵CFU/cm²時(shí)可保存6天。而菌落總數(shù)在l0³CFU/cm²時(shí)則可保存12天。 

3、食品中細(xì)菌數(shù)量可估測出食品變質(zhì)狀況 

一般認(rèn)為日常食品的活菌數(shù)為l0⁴～l0⁷CFU/g。而當(dāng)活菌數(shù)達(dá)到l0⁸CFU/g則可認(rèn)為處于初期變質(zhì)階段。例如，活的家禽，皮膚表面的細(xì)菌數(shù)可低到1.5×l0³CFU/cm²。而加工后馬上檢測可達(dá)3.5×l0⁴CFU/cm²。當(dāng)菌落數(shù)為l0⁷CFU/cm²時(shí)表示確已經(jīng)變質(zhì)，雞肉的細(xì)菌數(shù)達(dá)l0⁸CFU/cm²時(shí)可有氣味并變粘。

一般講，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則會(huì)加速變質(zhì)過程的進(jìn)程，甚至可能引起食用者的不良反應(yīng)。

菌落總數(shù)檢測方法

菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗(yàn)方法(GB4789.2-2022)。

基本操作一般包括：樣品的稀釋——傾注平皿——培養(yǎng)48（72）小時(shí)——計(jì)數(shù)報(bào)告。

1、操作方法

（1）以無菌操作取檢樣25g（或25mL)，放于225mL無菌生理鹽水或其他無菌緩沖溶液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或無菌均質(zhì)袋內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。

固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1～2min，制成1:10的均勻稀釋液。

（2）用1ml滅菌吸管或吸頭吸取1:10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的無菌試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1:100的稀釋液。

（3）另取1mL滅菌吸管或吸頭，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1mL滅菌吸管。

2、無菌操作

操作中必須有“無菌操作"的概念，所用玻璃器皿必須是滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘，每個(gè)平板不得超過5個(gè)菌落（具體的自己根據(jù)實(shí)際制定實(shí)驗(yàn)室的SOP）。

3、采樣的代表性

如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

4、稀釋液

樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。

1、操作方法

（1）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇1～3個(gè)適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。

（2）將涼至46℃～50℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15～20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

（3）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。 

（4）傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在48℃±2℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，也可以以皮膚感受較熱而不燙為宜。

傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12～20mL不等，一般以15mL較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察

（5）為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

（6）一般適溫較低，故多采用36℃，培養(yǎng)時(shí)間一般為48h。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15％。

（7）為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培養(yǎng)基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對照觀察。

在某些時(shí)候，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)。可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì)算出原始樣品中每克（或每mL）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。

2、計(jì)數(shù)

到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

3、稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式

（1）若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。

（2）若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式（l）計(jì)算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1）

式中：
N―樣品中菌落數(shù)；
∑C―平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；
n 1―第一個(gè)適宜稀釋度接種平板個(gè)數(shù)
n2―第二個(gè)適宜稀釋度接種平板個(gè)數(shù)；
d―稀釋因子（第一稀釋度）。

（3）若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

（4）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

（5）若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

（6）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一部分小于30或大于300時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

4、菌落總數(shù)的報(bào)告
（1）菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五人"原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。 

（2）大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五人"原則修約后，取前兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入"原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。

（3）若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。

（4）稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。

1、不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)（有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。

2、當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時(shí)，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。

3、當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。